IX Neapolitan Brain Group: grazie a tutti i partecipanti!

Il 12 dicembre 2019, presso il Telethon Institute of Genetics And Medicine (Tigem), nella sede di Pozzuoli, si è svolto il primo meeting congiunto promosso da Ennio Del Giudice, Presidente del Neapolitan Brain Group e Andrea Ballabio, Direttore del Tigem.

L’incontro è anche stato il IX meeting consecutivo organizzato dal Neapolitan Brain Group (NBG). Il programma dell’evento si è articolato in due sessioni, la prima al mattino e la seconda al pomeriggio, entrambe precedute da due letture magistrali, rispettivamente sul ruolo emergente dei condotti cellulari denominati TNTs (tunnelling nanotubes) tenuta da Chiara Zurzolo e sulle malattie neurodegenerative da proteinopatia tenuta da Vincenzo Alessandro Gennarino.

Hanno fatto seguito due sezioni denominate: From the bedside to the bench e From the bench to the bedside in cui due clinici (Nicola Brunetti-Pierri e Pasquale Striano) e due ricercatori di base (Vincenzo Nigro e Maurizio Taglialatela) si sono confrontati sui contributi personali che ciascuno è potenzialmente in grado di fornire alla comprensione e al trattamento delle patologie del sistema nervoso. La terza parte del programma ha previsto, tra mattina e pomeriggio, la presentazione orale di 12 comunicazioni selezionate da un comitato di revisori internazionali a partire da tutte quelle inviate dopo una formale call for abstracts. Si è anche tenuta una Sessione dedicata ai poster in cui sono stati brevemente discussi i singoli contenuti.

Nel complesso sono stati presentati nel corso della giornata più di 50 nuovi contributi di ricerca nel campo delle neuroscienze, provenienti da Centri regionali sia universitari che afferenti al CNR (es.: Università di Napoli Federico II, Università della Campania Luigi Vanvitelli, Università di Salerno, Tigem, CEINGE, IBBR, IBB, ISPAAM, ISASI, ICB) e alcuni anche da centri extra-regionali (es.: Neuromed, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù Roma, European Brain Research Institute EBRI, Roma). Da segnalare che le ricerche presentate si sono anche avvalse di collaborazioni con Istituti di ricerca italiani (es.: Istituto Scientifico San Raffaele Milano, Università di Roma “La Sapienza”, Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati (SISSA) Trieste, etc.) e stranieri (es.: Lausanne University Hospital, University of Cambridge, University of Zurich, University of California Los Angeles, Max Planck Institute of Psychiatry Munich, etc.).

I contributi sono stati presentati nella quasi totalità dei casi dai più giovani esponenti dei gruppi di ricerca. Infatti, una delle mission del gruppo NBG è appunto quella di promuovere la partecipazione attiva dei ricercatori più giovani per stimolarne le doti scientifiche e di confronto con la finalità ultima di unire in una sorta di rete culturale tutti i Centri dell’area campana in cui si fanno clinica e/o ricerca di base dedicate allo studio della fisiologia e della patologia del sistema nervoso.

Il libro degli abstract è disponibile per il download in versione pdf.

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Endocannabinoid Research Group

di Vincenzo Di Marzo

L’Endocannabinoid Research Group (ERG) è un gruppo di ricerca multidisciplinare fondato nel 1995 dal Prof. Vincenzo Di Marzo nei laboratori dell’Istituto di Chimica Biomolecolare del Consiglio Nazionale delle Ricerche (ICB-CNR) di Pozzuoli (NA). A tale gruppo aderirono, e contribuirono alla sua nascita, vari Istituti di ricerca del CNR e Università dell’area napoletana e salernitana (Università degli Studi di Napoli “Federico II”, Università degli Studi della Campania “Luigi Vanvitelli” e Università degli Studi di Salerno). Storicamente l’oggetto della ricerca scientifica dell’ERG è lo studio degli Endocannabinoidi e delle ammidi bioattive degli acidi grassi a lunga catena. Tuttavia dal 1995 ad oggi la conoscenza del Sistema Endocannabinoide e lo studio degli elementi che ne fanno parte si è estesa notevolmente. Infatti, le scoperte dell’ultimo decennio hanno suggerito di espandere la nostra visione di tale sistema e di considerarlo come un vero e proprio –oma, rinominato quindi “endocannabinoidoma”.

In ambito medico scientifico il termine “Sistema Endocannabinoide - ECS” fa riferimento a un numeroso gruppo di molecole che nel nostro organismo adempie alla produzione e funzione dei due principali mediatori lipidici endocannabinoidi noti come Anandamide (AEA) and 2-Arachidonoilglicerolo (2-AG). Sin dalla loro identificazione, è apparso evidente come sia l’AEA che il 2-AG giochino un ruolo di rilievo nel preservare l’omeostasi delle cellule, dei tessuti, degli organi e dell’organismo. Alterazioni dell’attività dell’AEA e del 2-AG sono state descritte in una pletora di disordini che interessano non solo il sistema nervoso centrale ma anche organi e tessuti periferici.

Nell’ambito delle Neuroscienze notevoli contributi sono stati forniti dall’ERG allo studio dell’endocannabinoidoma a partire dalla prima identificazione e caratterizzazione degli enzimi DAGLa e b, che giocano un ruolo chiave della biosintesi del 2-AG (Bisogno et al., JBC 2003), fino allo studio molecolare dei percorsi di segnalazione endocannabinoide-mediata fisiologicamente rilevanti e per i quali è stato dimostrato il ruolo omeostatico, in particolare nella regolazione ipotalamica dei circuiti dell’appetito (Di Marzo et al., Nature 2001; Cristino et al., PNAS 2013), nonché della loro disregolazione che sottende l’ obesità (Morello et al., PNAS 2016).

Ricerche dell’ERG hanno inoltre dimostrato come la modulazione del sistema endocannabinoide attraverso tools farmacologici o molecolari, anche mediante l’interazione con i recettori canale TRP(V), possa rappresentare una valida strategia terapeutica per il trattamento di patologie più o meno rare per le quali ad oggi non esiste ancora un trattamento terapeutico efficace. Esempio di ciò sono gli studi dove si dimostra come gli effetti neuroprotettivi che il cannabidiolo (CBD) ha in diversi modelli sperimentali di epilessia siano dovuti ad attivazione e veloce desensitizzazione del recettore canale TRPV1. Queste prove scientifiche corroborano, pertanto, l’impiego del cannabidiolo (oggi farmaco approvato FDA) come valida strategia terapeutica per il trattamento di alcune delle più severe forme di epilessia pediatriche farmaco resistenti come le Dravet e Lennoux Gasteau (Iannotti et al., ACS Chem Neurosci. 2014; Di Marzo, Nat Rev Drug Discov. 2018).

Gli sforzi del gruppo si concentrano anche sullo sviluppo di approcci di targeted lipidomics per identificare nuove molecole correlate agli endocannabinoidi ed investigarne il loro ruolo biologico sia in modelli di disordini neurodegenerativi che di trauma cranico. In particolare, molto recentemente, il gruppo ha dimostrato come nell’insula di un modello murino di mild-TBI il trauma producesse un aumento considerevole di un membro poco conosciuto della famiglia delle N-aciliglicine, l’N-oleoilglicina (OlGly), in grado di ridurre la preferenza alla nicotina e i sintomi da astinenza, fenomeno riportato essere associato ad alcune forme di mild-TBI (Donvito, Piscitelli et al., Neuropharmacology. 2019).

In aggiunta al sistema nervoso centrale, studi molto recenti eseguiti dal gruppo del Prof. Di Marzo, hanno dimostrato per la prima volta in ambito scientifico che: (i) sia in cellule muscolari murine che umane, il 2-AG gioca un ruolo chiave nella promozione del processo di proliferazione, ma al contrario impedisce il loro completo processo di maturazione mediante l’inibizione dei canali del potassio Kv7; (ii) il 2-AG ha un ruolo chiave durante le fasi di formazione e sviluppo del muscolo scheletrico sia in fase embrionale che post-natale; (iii) sia nei muscoli scheletrici dei topi che dei pazienti affetti da Distrofia muscolare di Duchenne, si riscontra un’aumentata attività del sistema endocannabinoide; (iv) l’inibizione farmacologica dell’ ECS risulta in un significativo miglioramento locomotorio e cognitivo nei topi affetti da distrofia muscolare di Duchenne (Iannotti et al., Nature Commun. 2018; Iannotti et al., Br J Pharmacol. 2018; Iannotti et al., PNAS 2014).

Un altro contributo fondamentale del gruppo di ricerca è stato lo sviluppo di nuove molecole per il targeting selettivo del sistema endocannabinoide e per l’uso terapeutico dei cannabinoidi in diverse malattie sia centrali che periferiche. In particolare, sono stati caratterizzati nuovi scaffold per il trattamemto di patologie infiammatorie cutanee (Mugnaini et al, Eur J Med Chem. 2019) e per il trattamento della malattia dell’Alzheimer (Montanari et al., Eur J Med Chem. 2019). Infine, il gruppo ERG è stato fra i primi a condurre studi pionieristici che proponessero l’utilizzo curativo e non palliativo di fitocannabinoidi non psicotropici in diverse patologie tumorali quali carcinoma della mammella (Ligresti et al. J Pharmacol Exp Ther. 2006) e carcinoma prostatico (De Petrocellis et al., Br J Pharmacol. 2013).

Oltre a tali evidenze, sforzi attuali del gruppo di studio di ricerca sugli endocannabinoidi puntano alla comprensione della funzione del microbiota intestinale e della sua interazione con l’endocannabinoidoma nel controllo delle funzioni del sistema nervoso centrale, periferico così come del sistema scheletrico muscolare. Tali connessioni funzionali sono conosciute come “asse intestino-cervello” e “asse intestino-muscolo”. Infatti, recentemente il Prof. Di Marzo è diventato direttore dell’Unita’ Mista Internazionale di Ricerca Chimica e Biomolecolare sul Microbioma tra CNR e Université Laval, Quebec City, Canada (www.umilaval.cnr.it).

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Un lavoro di Tesi per conoscere il mondo

di Q.A. Vassalli

Da sempre sono stato affascinato dalla complessità dell’occhio, come organo capace di farci conoscere il mondo. Aristotele diceva nella Metafisica: “Tutti gli uomini tendono per natura al sapere. Lo segnala il loro amore per le sensazioni, amate per se stesse, indipendentemente dall’utilità, preferita tra tutte la vista, non solo in vista dell’azione, ma anche senza intenzione pratica. Il motivo è che, mostrando la molteplicità delle differenze, la vista fa acquisire più delle altre sensazioni [nuove] conoscenze”.

I fotorecettori sono neuroni specializzati nella percezione degli stimoli luminosi e durante l’evoluzione si sono considerevolmente diversificati. Il meccanismo genetico che sottende il loro differenziamento e il progressivo aumento di complessità resta non del tutto delineato. Il mio progetto di dottorato, svolto nel laboratorio di biologia molecolare dello sviluppo, diretto dalla Dott.ssa Annamaria Locascio e dal Dott. Paolo Sordino, presso la Stazione Zoologica Anton Dohrn, aveva come scopo principale caratterizzare il grado di conservazione del pathway molecolare, regolato dal gene Onecut, nella morfogenesi dell’occhio e nel differenziamento dei fotorecettori durante l’evoluzione dei cordati.

Ho analizzato la funzione del gene Oc nel differenziamento dei fotorecettori in due diverse specie di cordato attraverso la creazione di organismi transgenici nell’ascidia Ciona robusta e mediante knockdown in zebrafish (Danio rerio).

La figura 1 mostra i fenotipi transgenici ottenuti attraverso esperimenti di elettroporazione in uova fecondate di Ciona di due forme di Onecut, una costitutivamente attiva (Vp16) (Fig.1 B) e una costitutivamente repressiva (WRPW) (Fig. 1 C), utilizzando un promotore specifico dei precursori dei fotorecettori (pGsx). L’espressione di questi due transgeni ha portato a specifici ed opposti effetti nel differenziamento dei fotorecettori e delle cellule pigmentate dell’ocello; più ocelli nella forma costitutivamente attiva e assenza di ocello nella forma costitutivamente repressiva. Tale studio ha dimostrato che OC è coinvolto nel pathway molecolare che controlla il differenziamento di fotorecettori e cellule pigmentate. Le cellule precursori dei fotorecettori degli embrioni transgenici OC:Vp16, OC:WRPW, e controllo sono state isolate ed utilizzate per un’analisi differenziale dei trascrittomi tramite RNA-sequencing. In particolare, i risultati del sequenziamento dei trascrittomi sono stati confrontati tra loro al fine di individuare i geni target di OC, regolati differenzialmente nelle due condizioni di attivazione e repressione costitutiva. L’analisi bioinformatica ha evidenziato la presenza di 470 geni per la condizione di attivazione e 57 geni per la condizione di repressione, differenzialmente espressi in maniera significativa. In particolare questa analisi ha mostrato che 21 di questi geni erano differenzialmente espressi in entrambe le condizioni (Fig.1 D).


La down-regolazione dei geni OC in zebrafish mediante microiniezione di oligonucleotidi antisenso (morfolino) per i geni OC1, OC2, OC-like, e l’iniezione contemporanea degli stessi tre morfolino, ha dimostrato la loro implicazione nello sviluppo dell’occhio dei vertebrati. Infatti, come si può vedere negli embrioni downregolati (morfanti) mostrati nella Figura 2, livelli ridotti di espressione di questi geni causano microftalmia con diametro dell'occhio più piccolo del 40-50% rispetto al controllo. Analisi mediante linee transgeniche dell’occhio e saggi di immunoistochimica mediante anticorpi specifici delle cellule della retina hanno mostrato la loro ridondante cooperazione nel differenziamento delle cellule retiniche, in particolare la loro azione è fondamentale nello sviluppo delle cellule orizzontali e del ganglio della retina.

L’analisi transcrittomica differenziale sugli embrioni transgenici di Ciona ha posto le basi per l'identificazione dei geni bersaglio di OC e per studiare la loro conservazione fino ai vertebrati. Molti dei geni risultati differenzialmente espressi in Ciona si sono mostrati down- o up-regolati negli embrioni morfanti di zebrafish, mediante RT-qPCR analisi, rivelando un ruolo primario conservato del gene OC nel differenziamento dei fotorecettori in tutti i cordati ad eccezione dei mammiferi.

Tale analisi, inoltre, ha identificato diversi target di OC, coinvolti nell'omeostasi del calcio e nella neurotrasmissione sinaptica. La stessa analisi ha anche evidenziato che funzioni geniche specifiche non sono sempre mantenute tra geni ortologhi, definiti dal punto di vista computazionale, mentre, spesso, sono condivise con altri paraloghi.

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