Da sempre sono stato affascinato dalla complessità dell’occhio, come organo capace di farci conoscere il mondo. Aristotele diceva nella Metafisica: “Tutti gli uomini tendono per natura al sapere. Lo segnala il loro amore per le sensazioni, amate per se stesse, indipendentemente dall’utilità, preferita tra tutte la vista, non solo in vista dell’azione, ma anche senza intenzione pratica. Il motivo è che, mostrando la molteplicità delle differenze, la vista fa acquisire più delle altre sensazioni [nuove] conoscenze”.
I fotorecettori sono neuroni specializzati nella percezione degli stimoli luminosi e durante l’evoluzione si sono considerevolmente diversificati. Il meccanismo genetico che sottende il loro differenziamento e il progressivo aumento di complessità resta non del tutto delineato. Il mio progetto di dottorato, svolto nel laboratorio di biologia molecolare dello sviluppo, diretto dalla Dott.ssa Annamaria Locascio e dal Dott. Paolo Sordino, presso la Stazione Zoologica Anton Dohrn, aveva come scopo principale caratterizzare il grado di conservazione del pathway molecolare, regolato dal gene Onecut, nella morfogenesi dell’occhio e nel differenziamento dei fotorecettori durante l’evoluzione dei cordati.
Ho analizzato la funzione del gene Oc nel differenziamento dei fotorecettori in due diverse specie di cordato attraverso la creazione di organismi transgenici nell’ascidia Ciona robusta e mediante knockdown in zebrafish (Danio rerio).
La figura 1 mostra i fenotipi transgenici ottenuti attraverso esperimenti di elettroporazione in uova fecondate di Ciona di due forme di Onecut, una costitutivamente attiva (Vp16) (Fig.1 B) e una costitutivamente repressiva (WRPW) (Fig. 1 C), utilizzando un promotore specifico dei precursori dei fotorecettori (pGsx). L’espressione di questi due transgeni ha portato a specifici ed opposti effetti nel differenziamento dei fotorecettori e delle cellule pigmentate dell’ocello; più ocelli nella forma costitutivamente attiva e assenza di ocello nella forma costitutivamente repressiva. Tale studio ha dimostrato che OC è coinvolto nel pathway molecolare che controlla il differenziamento di fotorecettori e cellule pigmentate. Le cellule precursori dei fotorecettori degli embrioni transgenici OC:Vp16, OC:WRPW, e controllo sono state isolate ed utilizzate per un’analisi differenziale dei trascrittomi tramite RNA-sequencing. In particolare, i risultati del sequenziamento dei trascrittomi sono stati confrontati tra loro al fine di individuare i geni target di OC, regolati differenzialmente nelle due condizioni di attivazione e repressione costitutiva. L’analisi bioinformatica ha evidenziato la presenza di 470 geni per la condizione di attivazione e 57 geni per la condizione di repressione, differenzialmente espressi in maniera significativa. In particolare questa analisi ha mostrato che 21 di questi geni erano differenzialmente espressi in entrambe le condizioni (Fig.1 D).
La down-regolazione dei geni OC in zebrafish mediante microiniezione di oligonucleotidi antisenso (morfolino) per i geni OC1, OC2, OC-like, e l’iniezione contemporanea degli stessi tre morfolino, ha dimostrato la loro implicazione nello sviluppo dell’occhio dei vertebrati. Infatti, come si può vedere negli embrioni downregolati (morfanti) mostrati nella Figura 2, livelli ridotti di espressione di questi geni causano microftalmia con diametro dell'occhio più piccolo del 40-50% rispetto al controllo. Analisi mediante linee transgeniche dell’occhio e saggi di immunoistochimica mediante anticorpi specifici delle cellule della retina hanno mostrato la loro ridondante cooperazione nel differenziamento delle cellule retiniche, in particolare la loro azione è fondamentale nello sviluppo delle cellule orizzontali e del ganglio della retina.
L’analisi transcrittomica differenziale sugli embrioni transgenici di Ciona ha posto le basi per l'identificazione dei geni bersaglio di OC e per studiare la loro conservazione fino ai vertebrati. Molti dei geni risultati differenzialmente espressi in Ciona si sono mostrati down- o up-regolati negli embrioni morfanti di zebrafish, mediante RT-qPCR analisi, rivelando un ruolo primario conservato del gene OC nel differenziamento dei fotorecettori in tutti i cordati ad eccezione dei mammiferi.
Tale analisi, inoltre, ha identificato diversi target di OC, coinvolti nell'omeostasi del calcio e nella neurotrasmissione sinaptica. La stessa analisi ha anche evidenziato che funzioni geniche specifiche non sono sempre mantenute tra geni ortologhi, definiti dal punto di vista computazionale, mentre, spesso, sono condivise con altri paraloghi.
